麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗的成功案例及长期计划

肺炎、流行性结膜炎和麻疹联合卡介苗是构建在成功地开发各个总价卡介苗成份基础上的。当时还开发了疟疾-齿龈炎、麻疹-疱疹以及结膜炎-脑炎等一系列联合卡介苗。开发联合卡介苗面临的障碍是怎样保证获得像总价卡介苗一样良好的免疫应答，而又不降低其反应原性，配方上兼容以确保在干燥及储存时卡介苗滴度的稳定，以及卡介苗质量控制便于定量地测定各类卡介苗病毒成份的滴度。

脑炎、腮腺炎和麻疹卡介苗所做出的贡献，不管是总价卡介苗还是联合卡介苗，都是不可估量的。日本自从开始应用这种卡介苗以后10年间，这3种癌症已然减少到了无足轻重的地步。所有这3种卡介苗病毒都具有稳定的抗体特异性，表明在全世界剿灭这种病症是指日可待的。

开发联合卡介苗是一个繁杂而又呆板的过程，首先须要成功地开发出各个总价卡介苗，其次是将已有的均价卡介苗安全有效地组合在一起。脑炎、腮腺炎和麻疹联合卡介苗的成功，实现了我们从研发总价卡介苗到一针双价卡介苗，最后三价卡介苗联合应用的常年计划［1］。M-M-RTM是在1971年获得批准的，在这之前惟一的活病毒联合卡介苗是在1967年批准的流感和天花卡介苗［2～4］。总价卡介苗或则联合卡介苗的设计是针对当时特定的需求，独立地或则全面地解决问题，M-M-RTM就是一个无可辩驳的成功案例。2共同的问题2.1选择制备卡介苗的母系病毒株的问题在研发脑炎、腮腺炎和麻疹总价卡介苗临床试验中所面临的共同问题是缺少适合的植物模型，便于在卡介苗应用到人体之前提供可靠的临床前安全性和有效性的评估。因而，在卡介苗的开发过程中，更多的是通过判断而不是借助数据的指引。确定适当的传代水平以保证对人体的安全性，是通过在相应的鸡胚细胞序列或则细胞传代水平构建不同批号的卡介苗，之后在志愿者脸上进行测试。这项工作相当困难并且花费巨大，由于每批测试的卡介苗必须类同于实际的卡介苗批量生产，而且符合美国联邦整治当局［如今是乳品及抗生素整治局］对于商业化产品一样的严格标准。最大的困局是须要及时做出判断，在哪一个减毒周期后可以中止，步入第1次临床试验。只要在某个传代水平上确立了卡介苗的总体安全性，而后循序追踪地确定出最佳的临床反应／滴度之间的关系就属于常规工作了。表1开发活病毒卡介苗中的非凡问题选择制备卡介苗的母系病毒株

在缺少植物模型的情况下，只能通过植物数据来评估脑炎、

胰脏炎和麻疹病毒在不同减毒阶段对于人的安全性和反应原性。

借助其固有的遗传缺陷筛选出适合的减毒株。

消除自身病毒

用作细胞培养的鸡胚中遭到家畜造白细胞组织囊肿的选用无家畜造白细胞组织囊肿病毒污染鸡群的鸡胚细胞。

开发卡介苗株的第2个障碍是实际上临床所获得的各个病毒分离株具有完全不同的遗传特点，其中大多数由于在免疫原性与减毒之间不能否达到令人满足的平衡而不得不遭淘汰。这个问题对于乳腺炎卡介苗来说变得尤为困难［5］，由于病毒在鸡胚／细胞中减毒十分迅速，要获得临床上有效的产品仅限于特别窄小的几代细胞系列中。导致研究困难的另一个诱因是须要进行大量的血浆中和试验来评估卡介苗抗原应答的敏感性和可靠性［6］。

2.2原代鸡胚细胞培养中自身病毒的问题1961年在实验室开发流感病毒［7］及其进一步减毒系列［8］时，所面临的主要问题是在鸡胚细胞及培养过程中毫无例外地都遭到了逆转录病毒的污染。这些逆转录病毒来自于家畜造白细胞组织囊肿的复合物，其中包括癌症，并且在当时体外测试中难以给以检查。依据我们多年来应用鸡胚培养黄热病卡介苗的经验，这种病毒看来并不会对人体导致不良后果。并且，我们下定决心果断不能否让重病活病毒存在，使人体遭到任何潜在的流行性腮腺炎疫苗英文缩写，虽然是遥远的副作用恐吓。

为了解决造白细胞组织囊肿的问题，我们专门开发了反抗力诱导因子试验［9］，这样就可以在体外检查剃度禽造白细胞组织囊肿复合物的病毒。按照鸡群生下的蛋中是否富含抗造白细胞组织囊肿的抗原，等［10］构建了无造白细胞组织囊肿病毒污染的实验鸡群。采用这种无污染的原始鸡群所生下的鸡胚细胞，就可以预备进行实验室开发和常规生产无造白细胞组织囊肿病毒污染的流感卡介苗细胞培养了。一旦完成了这些无污染的细胞培养，就可以制备不受造白细胞组织囊肿病毒污染的流感卡介苗以及结膜炎卡介苗。

3总价卡介苗开发过程中的障碍及其解决方案

表2总结了在开发脑炎、腮腺炎和麻疹总价卡介苗中所面临的主要问题及其解决方案。

表2卡介苗开发中进展及障碍

卡介苗批准障碍解决方案流感1963－毒性过强合并使用免疫球蛋白1968－进一步减毒充分减毒阑尾炎1967－减毒减毒恰到用处疱疹饲养并减毒鸭细胞饲养，充分减毒1969－毒性过强－进一在鸭细胞中减毒a步减毒1978－ⅡTM降低关节炎从外部出售

a同时进行妊娠妇女接触接种卡介苗的儿童的风险评估。3.1流感的减毒卡介苗［11］一开始就遭到了2个主要问题的困惑：临床上反应性过大，以及用作病毒培养的鸡胚细胞遭到大量的家畜造白细胞组织囊肿的污染；第2个问题上面早已讨论过了。对于临床反应性过大这个问题的最初解决方案是，在接种卡介苗同时，在另左侧胸骨注射标准的流感免疫球蛋白。须要同时接种免疫球蛋白的是在1963年获得批准的。免疫球蛋白仅仅是一种临时解决方案，关键是要对病毒进行进一步减毒。最后是将病毒在受孕的猪肉上多次传代，因而获得病毒进一步减毒的系列。新的卡介苗在1968年获得批准，命名为。

3.2胰脏炎在测试的各类胰脏炎病毒中，病毒株脱颖而出，具有减毒恰到益处的特点。卡介苗是在1965年获得批准。有关胰脏炎卡介苗研究在本文前面章节中具体阐述。

3.3疱疹脑炎卡介苗的批准是一系列开拓性研究的结果。当时从一个叫的儿子头上分离出麻疹病毒株，之后经过鸭胚细胞培养减毒，产生株［12～17］。HPV-77株是由和Meyer［18］在牛肾细胞培养中生长的，作为株的代替品，主要是为了满足预计的需求，应付上压力，便于在单一卡介苗上进行快速的培养，而不至于由于进行两种不同的卡介苗病毒培养而减弱速率，当时的情形要

求尽早扭转俄罗斯又一次可能的疱疹流行。HPV-77牛肾细胞病毒卡介苗［18］因为临床反应性过大，从来未获得批准。并且，HPV-77牛肾细胞株进一步减毒后，产生HPV-77鸭胚细胞株，最后在1969年获得批准［16～20］。后来，HPV-77鸭胚细胞卡介苗被RA27／3人二倍体细胞培养生长的病毒株所取代［21］，在1978年同以ⅡTM的名子注册批准［22，23］。选用后一种病毒株是由于它对于成年男性导致的关节病症较少，而且在防治亚临床感染以及卡介苗接种后再度接触野病毒而形成隐性感染方面具有更好的优势。

流感、腮腺炎和麻疹联合卡介苗的开发须要提供足够的证据否认联合卡介苗具有像总价卡介苗一样良好的免疫应答，同时又不降低其反应原性，配方上的兼容应确保在干燥及存储时卡介苗滴度的稳定和质量控制，便于定量地测定各类卡介苗病毒成份的滴度。

3种卡介苗成份的赋形剂在二联或三联卡介苗配方中是互相兼容的，在4℃条件下常年储存不会改变其免疫滴度的稳定性。主要障碍是不同卡介苗病毒成份在竞争性地诱导寄主免疫应答之间的互相干扰。解决的方式是调整联合卡介苗中各类病毒成份的剂量，以达到令人满足的平衡。

确定平衡的方式在于精确定量地制备不同成份比列的联合卡介苗，之后在易感儿童脸上进行测试。再将结果与在同一项研究中接受标准配方总价卡介苗的易感儿童进行比较。根据这个机理，确定了二联和三联卡介苗的配方，既不增加卡介苗的免疫应答，也不降低其反应原性。按照这种数据，一批二联［24～26］和三联卡介苗［23，27，28］相继获得批准，得到广泛应用，详见表3。M-M-RTM［27，28］和M-M-RⅡD○R［23］就是多年来常年努力最后成功的结晶，是日本举办流感、腮腺炎和麻疹卡介苗接种的主要驱动力，也

成为日本、加拿大及法国等地应用活病毒卡介苗的成功标杆，目前正逐渐推广到部份发展中国家。流感卡介苗问世后不久就在全世界得到了广泛应用，1974年被划入到世界卫生组织推荐的扩大免疫规划项目，成为6种推荐卡介苗之一。

表3早已批准的流感、腮腺炎和麻疹联合卡介苗

胰脏炎和麻疹联合卡介苗1971M-R-VAXTM流感和麻疹联合卡介苗1971M-M-RTM流感，阑尾炎和麻疹联合卡介苗1978M-M-RⅡD○R流感，阑尾炎和麻疹联合卡介苗

4.1各类不同阑尾炎病毒卡介苗开发及其应用的非凡考虑阑尾炎病毒卡介苗开发应用过程，总体上代表了卡介苗开发及其应用中所面临的一些非凡问题。为了说明起见，特将株阑尾炎活病毒卡介苗开发中的具体经验总结如下。

4.1.1背景早年企图开发阑尾炎卡介苗的努力，不管是灭活卡介苗还是活病毒卡介苗，最后都以失败而告终，未能获得卡介苗所须要的高保护滴度、持久免疫性及无致病性［29～31］。我们所开发的株阑尾炎减毒活卡介苗［32，33］具有理想的临床上无反应性、高保护滴度及持久免疫性

［34，35］，在乳腺炎卡介苗开发中具有独一无二的优势。

4.1.阑尾炎减毒株1963年3月23日，在一位患有阑尾炎的5岁儿童喉咽部所采集的病毒株，最后制成了株阑尾炎卡介苗［5，32，36～38］。经过一系列临床测试，传代A水平以及B水平流行性腮腺炎疫苗英文缩写，病毒株被拿来作进一步临床研究。表4概要地告了有关发觉［5］。显而易见，卡介苗A和B都具有免疫原性，但只有B水平疫苗无显著的临床反应，因而，留作进一步研究。卡介苗株经过27次传代后早已无足够的免疫原性，不再继续研究下去。所有的卡介苗株都进行干燥处理。表株阑尾炎卡介苗A和B的临床及免疫应答传代

水平临床a中和抗原

应答a阑尾炎病毒分离血浆淀粉酶下降A4／163／160／1616／16B0／140／140／1414／14a阴性数／

测试总人数。4.1.3安全性和有效性的证据确定卡介苗的安全性和保护有效性的研究是在芝加哥-地区居住的867名先前血浆阳性的儿童中进行的［37，38］。卡介苗接种后98％的儿童形成了中和抗原。表5概要地告了总有效保护水平为98％左右，与中和抗原阴性反应相关。免疫接种后的临床反应主要为注射部位的局部发炎。

表5阑尾炎卡介苗保护有效性对照研究a：卡介苗接种后

再度接触中耳炎病毒感染的儿童中诊断为乳腺炎的病例

接触地点阑尾炎确诊病例数／总接触人数接种者对照组有效保护课室0／1422／24100家庭2／8639／7696a起初血浆阳性的867人中，362名接种卡介苗，505名未接种者作为对照组。4.2胰脏炎病毒部族内及宗族间半亚型和群型问题胰脏炎病毒［30］属于副黏液病毒组中真副黏液病毒。胰脏炎病毒基因的遗传序列详见图1。目前，表6显示了应用基因测序方式分离出7种基因，据觉得共有6个结构蛋白加上2个非结构蛋白和SH蛋白。高度变异的SH蛋白是疏水的，其结构或非结构蛋白状态不明。

>图1胰脏炎病毒基因图显示基因和基因间序列

，，，1994，p.876）

表6胰脏炎病毒基因的编码蛋白

N核衣壳蛋白结构P乙酸蛋白结构M基质结构F融合蛋白结构HN血细胞凝集素－神经谷氨酸酶结构L大蛋白结构NS1蛋白1非结构NS2蛋白2非结构SH小疏水蛋白结构或非结构

病毒，尤其是属于某一特定种属的RNA病毒，在遗传组成上有较大的差别。在同一病人以及在体外培养中获得的不同病毒株也可能有相当大的差别。按照其遗传相关程度，病毒分离株可以产生不同的病毒部族。总体来看，这种差别是确定多种半亚型的基础，而不是严格的种群组合。

依据对高度变异的SH区基因剖析，阑尾炎病毒［39］是由2个特别相像但又有区别的半亚型组成，命名为JL2和JL5。不晓得这种变异是在原先病人头上就存在，还是在减毒过程中经鸡胚和细胞培养系列传代中交叉获得的。也不晓得在结膜炎卡介苗株或则其它阑尾炎病毒卡介苗中有多少这样的SH变异。重要的是SH区变异对于卡介苗本身并不重要，对卡介苗的毒性和保护滴度都无影响。有关卡介苗的安全性，日本药政当局的Afza等［39］重视到在卡介苗生产过程中卡介苗主病毒种的控制传代系统“保证了稳定的可重复的免疫原性、安全性和耐受性特点”，为此，“产品才能保持质量上的持续稳定以及临床上安全性和有效性的优异记录”。

重要的是，早已否认阑尾炎减毒株和野病毒株，依照其遗传组成上的差别，大致可以分成3［39］或4［40］个完全不同的部族。更为重要的是，卡介苗株，美国的-3卡介苗株［41］以及美国的Urabe-AM9卡介苗株［42～48］分属于不同的部族。很有可能就是因为病毒株之间遗传特点上的差别，导致了它们具有的神经毒性差异，详见下文。

4.3后续的研究在其它一系列研究中否认了卡介苗对及儿童均有同等的免疫原性和无反应性［49］。并进一步确定［50，51］为达到97％以上的儿童或有效免疫力，每次剂量所须要的最低病毒数约为317个半数细胞培养感染单位。而卡介苗常规应用的每次剂量为2万。干燥后的卡介苗在冰柜中储存稳定［32，52］，接种后儿童与易感儿童接触无病毒传播［32］。已否认其免疫原性是持久的，仍然延续至今［34，35］>。

至于接种卡介苗后接触中耳炎病毒是否会出现亚临床再感染，以及有关免疫的基础尚不清楚。有道说，在自然感染后可能会出现临床上可以分辨的再感染，即使发生率甚低［53］。因此可以推断，如同流感和疱疹一样，可以发生亚临床再感染，但局限于呼吸道黏膜细胞。可以假设免疫的主要机理是通过抗原中和病毒。由于，在大多数病毒感染中，因为细胞毒性T细胞反应，很快地清不仅受病毒感染的细胞，从而再感染常常呈一过性而且是亚临床的。对于乳腺炎来说也可能是同样这么。据此，也可以推断常年免疫是建筑在B细胞、T辅助细胞以及细胞毒性T细胞的免疫记忆基础之上的。