铁皮石斛多糖的提取方法有哪些？微波辅助提取法

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技术领域：

】本发明属于动物黄酮领域，具体涉及一种铁皮玄参活性成份的提取方式。

背景技术：

：铁皮玄参是属兰科玄参多年附生的草本动物，俗名黑节草、铁猪笼草，是中国传统的名贵草药，享有“救命仙草”、“中华仙草”等盛誉。铁皮玄参已被《中华人民共和国药典(2015版)》收载。铁皮玄参中富含黄酮、生物碱、菲类和微量元素等，其中铁皮玄参黄酮是最主要的活性成份，具有的抗氧化、抗衰老和医治个别癌症等作用，因而作为功效原料广泛应用于药品、保健乳品和彩妆品。铁皮玄参提取物已作为护肤品原料收录于《已使用护肤品原料名称目录(2015版)》中，同时《中华人民共和国药典》也将铁皮玄参黄酮的浓度作为评价铁皮玄参质量的重要指标。玄参黄酮的提取多采用传统的水提醇沉方式，原理是基于黄酮易溶于水、不溶或微容于有机溶剂的性质，用高含量乙酸(80％左右)将其从水底沉淀析出，再用适量无水甲醇或乙醇漂洗，经冷藏干燥后获得粗黄酮，其基本流程是：样品→脱脂→70％～80％甲醇除杂→蒸馏水浸提→醇沉过夜→离心→冷冻干燥→粗黄酮。超声波辅助提取法是基于超声波的机械效应、热效应和湍流效应作用，进而减小物质分子运动的频度和速率，提升溶剂穿击力，推动有效物质溶出，因而减短提取时间。近些年来，又有若干制备工艺在玄参黄酮的提取中获得应用。微波辅助提取法是基于微波穿透能力强的特性，借助物质在微波场中吸收微波能力的差别，使物质的个别区域或个别组分被选择性溶出。

闪式提取法是一种用于动物软硬组织破碎的新型提取技术，借助高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在温度及溶剂存在下数秒内把物料粉碎至细微颗粒，并使有效成份迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取的目的，具有溶剂药量少、提取时间短、效率高等优点。酶解提取法是指借助酶促反应，加速动物细胞壁结构的破坏，因而有利于有效成份从细胞中释放下来，减短提取时间，同时酶促反应是在较温和的条件下进行，可以有效减少生物活性物质的失活率。技术实现要素：本发明提供一种铁皮玄参活性成份的提取方式，才能高效地提取出玄参黄酮和铁皮玄参总生物碱，提升玄参黄酮提取率同时较大限度保持黄酮的活性。本发明的技术解决方案如下：一种铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，包括以下步骤：1)酶解提取：以80目以上的干铁皮玄参粗粉为原料，加入乙醇丙酮低脂，过滤，得到的滤渣ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂，在40～70℃进行酶解，酶解ph为3.0～6.0；升温使酶灭活，过滤，得到的滤渣ⅱ干燥后加入碱性丙酮加热回流进行醇提，过滤得到溶液①和滤渣ⅲ，在干燥的滤渣ⅲ中加盐进行水提，过滤得到溶液②和滤渣ⅳ；将溶液②浓缩至适量，加入乙酸醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣ⅴ干燥后得到粗黄酮；2)脱蛋白：取粗黄酮复溶，加入蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取碱液，加入由甲苯：正丁酯(vol)＝4.0:1～4.5:1产生的sevag试剂，剧烈回落，离心取碱液，重复上述步骤至无变性蛋白析出；3)脱色：向步骤2)中脱蛋白后的氨水加入活性炭或大孔吸附树脂进行脱色,脱气，得到滤液a；4)透析：将步骤3)中脱色后的氨水a进行透析去除水溶性小分子杂质，得到滤液b；5)干燥：将步骤4)处理后的氨水b冷藏干燥，得到铁皮玄参黄酮。

进一步的，上述步骤1)还包括：溶液①经过减压蒸干、1～2％硫酸水碱液溶化、二氯甲烷萃取、氨水调节ph＝8～12、氯仿萃取、减压蒸干，可以得到铁皮玄参总生物碱提取物。可以得到铁皮玄参总生物碱。进一步的，上述步骤1)的酶试剂为纤维素酶和/或鞣质酶，添加量为0.5～2.0％。进一步的，上述步骤1)中的磷酸丙酮的加入量为10～30倍量，气温为50～90℃。进一步的，上述步骤1)中的醇提为加入10～30倍量70～95％碱性丙酮(ph＝3～5)、40～70℃回流提取1.5～2.5h，重复1～4次。进一步的，上述步骤1)中的水提为加入10～30倍量水提取1～4h，重复1～4次。进一步的，上述步骤1)中的醇沉的含醇量为65～85％，醇沉时间为12～24h。进一步的，上述步骤2)中的蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种。进一步的，上述步骤2)中的sevag试剂与粗黄酮碱液的容积比为1∶3～1∶5。进一步的，上述步骤3)中的活性炭的加入量为0.5～1.5％，水浴时间为0.5～2h；或加入4～7％预处理后的大孔树脂于200r/min摇床回落吸附2h。进一步的，上述步骤4)为：将步骤3)中脱色后的氨水放入已处理好的透析袋中，放在容器圆通自来水，使水流自下而上；以后，按上述过程通纯净水透析，其中自来水透析24～48h、纯净水透析12～24h。

本发明的有益疗效：本发明以干铁皮玄参粗粉为原料，通过溶剂提取法去除脂胺类成份和醇胺类糖，保证粗黄酮有较高的含量，同时结合酶法在较温和的条件下分解动物组织，推动黄酮的释放，较大限度保持黄酮的活性，同时还可获得铁皮玄参总生物碱，在提纯黄酮的同时，降低名贵草药资源的浪费也可获得较高的经济效益；在粗黄酮碱液中富含大量蛋白质，这种蛋白质会结合黄酮产生糖蛋白，对后续的寡糖分离导致很大的影响，本发明通过sevag-酶联合脱蛋白法去除粗黄酮碱液中蛋白质，在传统的sevag法上结合酶法，以温和的条件使蛋白质变性，降低了蛋白脱除率铁皮石斛成分检测，增加了黄酮的损失；据悉，本发明在特定步骤结合了酶法，进一步增加了有机溶剂的使用量和工艺条件，提升了产品的含量和质量。与现有技术相比，本发明所述的一种铁皮玄参黄酮的提取及精制方式，依据副产物和杂质的特点，改变提取和萃取溶剂，适当引入生物酶，将铁皮玄参粗黄酮提取率由原先20％提升到30％以上，将副产物铁皮玄参总生物碱的提取率由原先的0.6％提升到3％以上；在联合脱蛋白中采用sevag试剂，防止了三氯乙醛法处理后黄酮发青和硫酸法分解黄酮的缺点，使得到的寡糖肉质雪白且浓度高，经蛋白酶处理后，明显的降低了sevag试剂使用次数，降低了有机溶剂的污染；经过本发明得到的寡糖具有更优越的抗氧化性，其自由基消除率低于常规产品。

【附图说明】图1为本发明的步骤流程示意图；图2为本发明黄酮脱色前后疗效对比结果；图3为本发明黄酮部份理化性质测量结果。【具体施行方法】下面用具体施行例对本发明做进一步详尽说明，但本发明除了局限于以下具体施行例。本发明公开了一种铁皮玄参活性成份的提取方式，主要步骤，如图1所示，具体包括：1)酶解提取：以80目以上的干铁皮玄参粗粉为原料，加入乙醇丙酮低脂，过滤，得到的滤渣ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂，在40～70℃进行酶解，酶解ph为3.0～6.0；升温使酶灭活，过滤，得到的滤渣ⅱ干燥后加入碱性丙酮加热回流进行醇提，过滤得到溶液①和滤渣ⅲ，在干燥的滤渣ⅲ中加盐进行水提，过滤得到溶液②和滤渣ⅳ；将溶液②浓缩至适量，加入乙酸醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣ⅴ干燥后得到粗黄酮；溶液①经过减压蒸干、1～2％硫酸水碱液溶化、二氯甲烷萃取、氨水调节ph＝8～12、氯仿萃取、减压蒸干可以得到铁皮玄参总生物碱提取物。酶试剂优选纤维素酶和/或鞣质酶，添加量为0.5～2.0％；磷酸丙酮优选加入量为10～30倍量，气温为50～90℃；醇提优选加入10～30倍量70～95％碱性丙酮、40～70℃回流提取1.5～2.5h，重复1～4次；水提优选加入10～30倍量水提取1～4h，重复1～4次；醇沉优选含醇量为65～85％，醇沉时间为12～24h。

2)脱蛋白：取粗黄酮复溶，加入蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取碱液，加入由甲苯：正丁酯(vol)＝4.0:1～4.5:1产生的sevag试剂，剧烈回落，离心取碱液，重复上述步骤至无变性蛋白析出；蛋白酶优选胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种，以去除粗黄酮氨水中蛋白质；sevag试剂与粗黄酮碱液的容积比优选为1∶3～1∶5。3)脱色：向步骤2)中脱蛋白后的氨水加入0.5～1.5％活性炭，进行水浴脱色，水浴时间优选为0.5～2h(或加入4～7％预处理后的大孔树脂于200r/min摇床回落吸附2h)，得到滤液a；4)透析：将步骤3)中脱色后的氨水a放入已处理好的透析袋中，放在容器圆通自来水，使水流自下而上；以后，按上述过程通纯净水透析，其中自来水透析24～48h、纯净水透析12～24h，得到滤液b；5)干燥：将步骤4)处理后的氨水b冷藏干燥，得到铁皮玄参黄酮。以下实例中，测量铁皮玄参黄酮浓度均采用丙酮-盐酸比色法，通过紫外分光光度法测定波长在488nm处的吸光度od484，标准曲线为od484＝83.254c0.1073(r2＝0.9993)；检查蛋白质浓度采用考马斯亮蓝g-250染色法，通过紫外分光光度法测定波长在595nm处的吸光度od595；检查色素通过紫外分光光度法测定波长在450nm处的吸光度od450。

铁皮玄参黄酮提取率根据以下公式估算：每次操作均各取0.1ml用于测量黄酮及蛋白质。按下式估算蛋白脱除率及黄酮保存率：脱色率按下式估算：以下实例中，测量铁皮玄参总生物碱浓度采用碱性颜料比色法，通过紫外分光光度法测定波长在620nm处的吸光度od620，标准曲线为od620＝0.1370c-0.1110(r2＝0.9997)。以下实例中，测量铁皮玄参黄酮抗氧化能力采用1,1-二甲基-2-苦肼基(dpph)法，通过紫外分光光度法测定波长在517nm处的吸光度od517，标准曲线为od517＝0.1706c0.1865(r2＝0.9937)。本发明所述的一种铁皮玄参黄酮的提取及精制方式，依据副产物和杂质的特点，改变提取和萃取溶剂，适当引入生物酶，将铁皮玄参粗黄酮提取率由原先20％提升到30.50％，将副产物铁皮玄参总生物碱的提取率由原先的0.6％提升到3.62％。在联合脱蛋白中采用sevag试剂，防止了三氯乙醛法处理后黄酮发青和硫酸法分解黄酮的缺点，使得到的寡糖肉质雪白且浓度高，经蛋白酶处理后，明显的降低了sevag试剂使用次数，降低了有机溶剂的污染。经过本发明得到的寡糖具有更优越的抗氧化性，其自由基消除率达到了53.21％。

以下所提供的施行例并非用以限制本发明所囊括的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行次序，所描述的方向仅限于附图。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。施行例一干铁皮玄参经粉碎过80目筛，得到铁皮玄参粗粉原料。分别取1.0g粗粉3份。3份均根据以下方式处理：粗粉加入10～30倍量氯仿丙酮加热1～2h，气温为50～90℃，过滤，滤渣i干燥后加入加适量水，调ph至3.0～6.0，加入0.5～2.0％纤维素酶和/或鞣质酶，40～70℃恒温酶解1.5～2.5h；迅速升温至90℃酶灭活10min，过滤，滤渣ⅱ干燥；加入10～30倍量75～95％碱性乙酸(ph＝3～5)、40～70℃回流提取1.5～2.5h进行醇提，重复两次，过滤合并溶液，得到溶液①和滤渣ⅲ；滤渣ⅲ干燥，加盐提取两次，过滤合并溶液，得到溶液②和滤渣ⅳ；将溶液②减压浓缩至适量，加入甲醇醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣ⅴ干燥后得到粗黄酮。经过估算，本施行例粗黄酮的平均提取率为(30.50±1.80)％。对比列一取与施行例一相同的1.0g干铁皮玄参粗粉3份，采用常规水提醇沉法按筛选出较佳的提取条件进行提取：用30倍量水70℃提取2h，重复提取两次。

经过估算，本施行例粗黄酮的平均提取率(15.01±0.64)％。施行例二称取3份3.0g上述施行例一所得的粗黄酮，分别加100ml水溶化，根据如下酶-sevag联合脱蛋白法进行脱蛋白：加入胰蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取碱液，加入sevag试剂(sevag试剂：丙酮：正丁酯(vol)＝4.0:1～4.5:1；sevag试剂与粗黄酮碱液的容积比优选为1∶3～1∶5)，剧烈回落，离心取碱液，重复上述步骤至无变性蛋白析出。结果发觉，重复3次操作后无显著变性蛋白沉淀。每次操作均各取0.1ml用于测量黄酮及蛋白质，检查结果如表1所示，结果以(x±s)表示。仅使用蛋白酶脱蛋白黄酮保存率和蛋白脱除率分别为(97.65±1.21)％、(60.11±2.31)％；使用胰蛋白酶-sevag联用法脱蛋白黄酮保存率和蛋白脱除率分别为(84.32±1.53)％、(78.70±2.08)％。对比列二称取3份3.0g与施行例二相同的粗黄酮，分别加100ml水溶化，根据如下sevag剂脱蛋白法进行脱蛋白：加入sevag试剂(sevag试剂：丙酮：正丁酯(vol)＝4.0:1～4.5:1；sevag试剂与粗黄酮碱液的容积比优选为1∶3～1∶5)，剧烈回落，离心取碱液，重复上述步骤至无变性蛋白析出。

使用sevag试剂法脱蛋白发觉起码须要7次才无显著变性蛋白沉淀。每次操作均各取0.1ml用于测量黄酮及蛋白质，检查结果如表1所示，结果以(x±s)表示，最终黄酮保存率和蛋白脱除率分别为(78.59±2.76)％、(73.69±2.11)％。表试剂法及胰蛋白酶-sevag联用法蛋白脱除率及黄酮保存率结果注：表1中每组方式三个样品，结果用平均数±方差表示；第一栏是使用蛋白酶脱蛋白，所以sevag试剂法第一栏无数据。施行例三分别取3份上述施行例中学脱蛋白后的寡糖碱液，分别加入0.5～1.5％活性炭，进行水浴脱色0.5～2h，脱气后测定脱色前后的脱色率及黄酮保存率，分别为(82.68±0.82)％、(86.43±0.45)％。脱色前后见图2。对比列三取与施行例三相同的3份脱蛋白后的寡糖碱液，加入4～7％预处理后的大孔树脂于200r/min摇床回落吸附2h，脱气后测定脱色前后的脱色率及黄酮保存率，分别为(65.52±0.99)％、(86.74±0.78)％。施行例四取2.0g干铁皮玄参粗粉按施行例一操作得到溶液①，减压蒸干，8ml1～2％硫酸碱液溶化，等容积加入乙醚萃取1次，溶液调水相ph＝8～12，用等容积丙酮萃取5次，合并乙酸层(减压蒸干后，得到铁皮玄参总生物碱)并定容于100ml，取5ml总生物碱碱液用于测量浓度并估算提取率。

平行实验三次，结果以(x±s)表示，铁皮玄参总生物碱提取率为(3.62±0.20)％。施行例五1,1-二甲基-2-苦肼基(dpph)是一种稳定的自由基(易溶于丙酮，且在517nm处有最大吸光度)。当加入自由基消除剂后，dpph吸光度会减缓或消失(dpph吸光度减弱程度与自由基清理程度呈线性关系)。因而可以借助dpph测定铁皮玄参黄酮去除自由基的能力，拿来代表铁皮玄参鞣质的抗氧化能力(即去除率越大，则表明物质清理能力越强，抗氧化能力越强)。按本发明方式制得铁皮玄参黄酮冻干粉，加盐配置成含量为1.0mg/ml的铁皮玄参黄酮碱液；用无水乙酸配制含量为4mg/ml的dpph氨水。分别将3.氨水加入到1.0ml铁皮玄参黄酮氨水与1.0ml分馏水底，混匀，温度避光30min，于517nm波长处检测od517(dpph铁皮玄参黄酮)和od517(dpph水)。将3.0ml无水乙酸加入1.0ml铁皮玄参黄酮碱液，于517nm波长处检测od517(苯酚铁皮玄参黄酮)。按照dpph标准曲线回归多项式估算出dpph质量含量，估算dpph自由基去除率。平行实验三次，结果以(x±s)表示，铁皮玄参鞣质的dpph自由基去除率为(53.21±1.15)％。

对比列五按对比列中学所述提取方式，减压浓缩，冻干后，制得铁皮玄参黄酮冻干粉，加盐配置成含量为1.0mg/ml的铁皮玄参黄酮氨水。根据施行例五的方式，估算dpph自由基去除率。平行实验三次，结果以(x±s)表示，铁皮玄参鞣质的dpph自由基去除率为(42.66±1.00)％。施行例六平行取按本发明方式制得铁皮玄参黄酮冻干粉(精黄酮)和对比列中学所制得铁皮玄参黄酮冻干粉(粗黄酮)各4份，分别加入茚三酮试剂、碘化钾试剂、双缩脲试剂、菲林试剂，观察性状。结果见图3和表2。由此说明，经过分离纯化后，可消除大量铁皮玄参黄酮里的水溶性杂质，因而提升铁皮玄参黄酮的含量。表2精黄酮和粗黄酮理化性质检测结果编号检查试剂/反应监测杂质精黄酮检查结果粗黄酮检查结果1茚三酮反应多肽阳性阴性(红色块状沉淀)2酸钾反应淀粉阳性阴性(碱液变黑)3双缩脲反应蛋白质阳性阴性(条状沉淀)4菲林试剂还原性糖阳性阳性当前第1页1 2 3 

技术特点：

1.一种铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，包括以下步骤：

1)酶解提取：以80目以上的干铁皮玄参粗粉为原料，加入乙醇丙酮低脂，过滤，得到的滤渣ⅰ干燥后中加入加适量水和酶试剂，在40～70℃进行酶解，酶解ph为3.0～6.0；升温使酶灭活，过滤，得到的滤渣ⅱ干燥后加入碱性丙酮加热回流进行醇提，过滤得到溶液①和滤渣ⅲ，在干燥的滤渣ⅲ中加盐进行水提，过滤得到溶液②和滤渣ⅳ；将溶液②浓缩至适量，加入乙酸醇沉，在2～5℃下醇沉过夜；过滤，得到的滤渣ⅴ干燥后得到粗黄酮；

2)脱蛋白：取粗黄酮复溶，加入蛋白酶30～50℃进行恒温处理，离心，取碱液，加入由甲苯：正丁酯(vol)＝4.0:1～4.5:1产生的sevag试剂，剧烈回落，离心取碱液，重复上述步骤至无变性蛋白析出；

3)脱色：向步骤2)中脱蛋白后的碱液加入活性炭或大孔吸附树脂脱色，脱气，得到滤液a；

4)透析：将步骤3)中脱色后的氨水a进行透析去除水溶性小分子杂质，得到滤液b；

5)干燥：将步骤4)处理后的氨水b冷藏干燥，得到铁皮玄参黄酮。

2.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤1)还包括：溶液①经过减压蒸干、1～2％硫酸水碱液溶化、二氯甲烷萃取、氨水调节ph＝8～12、氯仿萃取、减压蒸干可以得到铁皮玄参总生物碱提取物。

3.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤1)的酶试剂为纤维素酶和/或鞣质酶铁皮石斛成分检测，每100ml碱液添加酶试剂0.5～2.0g。

4.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤1)中的磷酸丙酮的加入量为10～30倍量，气温为50～90℃。

5.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤1)中的醇提为加入10～30倍量、ph＝3～5的70～95％碱性丙酮在40～70℃回流提取1.5～2.5h，重复1～4次。

6.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤1)中的水提为加入10～30倍量水提取1～4h，重复1～4次。

7.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤1)中的醇沉的含醇量为65～85％，醇沉时间为12～24h。

8.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤2)中的蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的一种或多种。

9.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤2)中的sevag试剂与粗黄酮碱液的容积比为1∶3～1∶5。

10.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤3)中的活性炭的加入量为每100ml碱液加入活性炭0.5～1.5g，水浴时间为0.5～2h；所述大孔吸附树脂的加入量为每100ml碱液4～7g，脱色过程为200r/min摇床回落吸附2h。

11.按照权力要求1所述的铁皮玄参活性成份的提取方式，其特点在于，所述步骤4)为：将步骤3)中脱色后的氨水放入已处理好的透析袋中，放在容器圆通自来水，使水流自下而上，然后再通纯净水透析，其中自来水透析24～48h、纯净水透析12～24h。

技术总结

本发明公开了一种铁皮玄参活性物质的提取方式，包括酶‑溶剂提取、酶‑Sevag试剂脱蛋白、活性炭脱色、透析、干燥步骤。本发明在常规水提取之前进行磷酸丙酮低脂和酶解，并在Sevag试剂脱蛋白前先酶解，有效地降低了铁皮玄参黄酮的释放、减少了铁皮玄参黄酮的损失、降低了脂胺类成份和醇胺类糖的浓度，同时保证了玄参黄酮较高的提取率和较高的活性。本方式避开了单一成份提取对名贵草药的浪费，在获得玄参黄酮的同时获得玄参碱，除了保持了黄酮的高焦比，且具有较高的经济效益。

技术研制人员：王淑玲;高建华;李欣岳;夏仙

受保护的技术使用者：北京奥得科技有限公司

技术研制日：2020.03.09

技术公布日：2020.05.26