神经元特异性烯醇化酶稳定剂及其制备方法介绍

本发明属于体外确诊试剂

技术领域：

，具体涉及一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂及其制备方式。本发明提供的稳定剂用于NSE的保存，就能明显提升NSE物理性质的稳定，维持其空间构型，增强其耐热性。

背景技术：

：神经元特异性烯醇化酶（e,NSE）是烯醇化酶的一种同工酶，NSE基因碱基序列全长，开放读码框架从第226到1531个核苷酸，厚度为，编码全部434个多肽。NSE生物半衰期可能大概20小时，NSE分子量为78kDa，等电点为pH4.7，是一种碱性蛋白酶，主要参与糖酵解，催化2-乙酸甘油弄成烯醇式乙酸乙酯酸。NSE广泛分布于人类及各类植物的成熟神经元、周围神经的神经内分泌细胞和一些觉得细胞中，正常人脑组织中浓度最高，起源于神经内分泌细胞的病变组织也有异常抒发。常见于神经母细胞瘤、小细胞白血病、胰腺癌、前列腺瘤、嗜铬细胞瘤等。正常情况下脑脊液和血浆中只富含微量（约15ng/mL）NSE，但在脑血管意外、脑外伤、脑病变等病症时，NSE可降低到几千ng/mL。NSE浓度的下降是因为NSE分泌到神经细胞外或是因为神经元损坏而释放出细胞外，目前还不清楚。在起源于神经外胚层或神经内分泌组织的癌症患者血浆、脑脊液中NSE水平下降，其中患小细胞白血病和神经母细胞瘤的病人尤为显著。目前NSE被觉得是脑损伤（神经母细胞瘤、急性脑血管疾患、缺氧性损伤等）和小细胞肿瘤（SCLC）的一项高特异性和高敏感性的生化指标，对小细胞白血病患者和脑部损伤患者的初期确诊、病情检测、疗效评价等有重要价值。

小细胞白血病、神经母细胞瘤、神经内分泌细胞病变（如嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤、黑色素瘤）等疾患中NSE水平增高，测量NSE可用于辅助确诊、病情检测、疗效评价和恶变预报。检测小细胞白血病的恶变，比临床确定恶变要早4～12周。NSE还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的辅助确诊，后者NSE异常增高而前者增高不显著。正是因为NSE的测量在临床上具有重要的应用价值，人们早已逐步开发出用于NSE测量的体外确诊试剂盒，然而一般情况下，NSE的生物半衰期大概为20h，难于常年稳定保存。为了解决此问题，人们通常采用急冻干燥的技术，将NSE氨水制备成冻干粉，以解决NSE稳定性差，无法保存的问题。并且目前NSE的配置保存存在以下不足：（1）急冻干燥技术须要用到急冻干燥机，降低了设备投入和维护管理成本；（2）因为NSE非常不稳定，滤液配制过程中NSE活性容易衰减，加上冷藏干燥工艺本身稳定性较差，这样会导不同批次间偏差较大。（3）对大夫使用来说，冻干粉在使用前须要复溶和混匀，降低了操作步骤和时间成本；复溶后的氨水保存周期短，假如复溶后短期内没有使用完，则不可再用，会导致浪费。（4）NSE的不稳定，给企业生产降低了难度和增强了生产成本；给大夫使用带来了不便；给病人降低了检查成本。

技术实现要素：神经元特异性烯醇化酶（e,NSE）生物半衰期短，保存稳定性差，造成NSE保存稳定性差的缘由的文献研究报导不多。本申请发明人在大量实验研究的基础上，逐渐弄清楚NSE保存稳定性差的缘由，通过筛选上百种保存液配方，最终配置出了才能促使NSE常年稳定保存的稳定剂。本发明解决上述问题所采用的技术方案为：一种神经元特异性烯醇化酶稳定剂，通过如下配比的原料制备而成：10～·HCl缓冲液，pH7.4、3～6g/LNaCl、5～20g/L蔗糖、5～100g/L海藻糖、1～10g/L酪蛋白、5～50g/L牛血清白蛋白、1～30g/、0.1～1.5g/L赖谷氨酸、0.4～20g/L乙二胺四羧酸二钠、0.5～10g/L二硫苏糖醇、1%～10%（v/v）甘油、0.01%～0.5%（v/v）Tween-20、0.01%～0.5%（v/v）-100、终含量100～/mL抑肽酶、0.02%～0.1%（v/v），超纯水作为溶剂。配制步骤如下：1）称取Tris，加入超纯水溶化，配成50mM的Tris碱液，用硫酸调节pH至7.4的缓冲碱液；2）依次称取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、、赖谷氨酸、乙二胺四羧酸二钠、二硫苏糖醇，溶化于Tris·HCl缓冲液；3）取甘油、Tween-20、-100、抑肽酶和加入步骤2配制好的氨水中，充分搅拌溶化，滤液混匀后用0.22μm滤器过滤，0～10℃保存本发明的稳定剂才能促使非常不稳定的神经元特异性烯醇化酶液态下37℃恒温放置7天活性增长大于10%，温度（25℃）放置15天活性增长大于10%，4℃放置1年活性增长大于10%，因而明显改善NSE体外确诊试剂盒货架寿命，增强其商业价值。

原理说明如下：（1）维持NSE本身物理结构不变：通过加入还原剂和抗氧化剂，避免NSE本身发生氧化还原反应，进而避免NSE本身物理结构发生改变。（2）维持NSE活性中心分子构型不变：通过加入单一的或复配的脂类、多甲基类、蛋白质类、氨基酸类、非离子型表面活性剂类等保护剂，通过构象、静电、疏水等斥力，以及通过降低空间位阻、提高体系黏度、提高NSE的玻璃化转变体温等方法来维持NSE活性中心的分子构型不变。（3）避免微生物及酶对NSE分子结构的破坏：通过加入防腐剂、酶抑制物来避免微生物及酶对NSE分子结构的破坏。所用抗氧剂乙二胺四羧酸二钠的含量优选为8g/L；防腐剂的含量优选为0.05%（v/v）。所用盐种类为NaCl，优选含量优选为5g/L。所用缓冲碱液Tris·HCl的含量优选为50mM。所用脂类保护剂采用非还原性二糖蔗糖和海藻糖复配物，蔗糖含量优选为10g/L，海藻糖含量优选为50g/L。所用多烷基类保护剂为小分子的甘油和大分子的聚乙二醇（）的复配物，甘油含量优选为10%（v/v），含量优选为5g/L。所用蛋白类保护剂为酪蛋白和牛血清白蛋白的复配物，酪蛋白含量优选为3g/L，牛血清白蛋白含量优选为20g/L。

所用多肽类保护剂为赖谷氨酸，赖谷氨酸含量为1g/L。所用还原剂为二硫苏糖醇，含量优选为3g/L。非离子型表面活性剂采用Tween-20和-100的复配物，其中Tween-20含量优选为0.1%（v/v）、-100含量优选为0.2%（v/v）。所用抑肽酶的浓度优选为/mL。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的稳定剂才能促使非常不稳定的神经元特异性烯醇化酶NSE液态下37℃恒温放置7天活性增长大于10%，温度（25℃）放置15天活性增长大于10%，4℃放置1年活性增长大于10%，因而明显改善NSE体外确诊试剂盒货架寿命，增强其商业价值。从生产企业角度看，无需配置冷藏干燥设备，NSE无需制成冻干粉，可以直接液态保存，节约了设备成本，简化了产品配置工艺，同时提升了产品生产稳定性。从检查医师角度看，无需复溶，产品即开即用，且未一次性用完时，仍可以于4℃放置30天以上，保存期间可继续使用，带来便捷的同时降低了浪费；从病人角度看，企业生产成本和检查成本的增加，看病时的测量成本也就增加了。附图说明图1为本发明施行例与对比列在4℃保存条件下不同保存时间NSE的稳定性；图2为本发明施行例与对比列在25℃（温度）保存条件下不同保存时间NSE的稳定性；图3为本发明施行例与对比列在37℃保存条件下不同保存时间NSE的稳定性。

具体施行方法以下结合具体施行例对本发明进行说明，所举的施行例仅是对本发明产品或方式作概括性例示，有助于更好地理解本发明，但并不会限制本发明范围。下列施行例中所述实验方式，如无特殊说明，均为常规方式；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本施行例1提供的NSE稳定剂包含的组分及浓度如下：组分浓度Tris·HCl缓冲液，pH=7./L蔗糖10g/L海藻糖50g/L酪蛋白3g/L牛血清白蛋白20g//L赖谷氨酸1g/L乙二胺四羧酸二钠8g/L二硫苏糖醇3g/L甘油10%（v/v）Tween-200.1%（v/v）-1000.2%（v/v）抑肽酶/.05%（v/v）制备步骤为：1.称取Tris适量，加入超纯水溶化，配成50mM的Tris碱液，用硫酸调节pH=7.4；2.依次称取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、、赖谷氨酸、乙二胺四羧酸二钠、二硫苏糖醇，溶化于Tris·HCl缓冲液；3.取甘油、Tween-20、-100、抑肽酶和加入上述配制好的氨水中，充分搅拌溶化，最后用0.22μm滤器过滤，4℃保存备用。

NSE稳定剂对NSE保存稳定性考察：评价原理。采用物理发光免疫剖析法，通过发光值的变化来评价NSE活性的变化，其过程为：链霉亲和素包被板先与-Anti-NSE结合，之后与NSE结合，最后再加入HRP-Anti-NSE，经过漂洗后，加入发光底物液，发光底物液可在HRP催化下进行物理发光，且在一定范围内发光硬度与NSE的浓度成反比。评价方式：以国际著名品牌商品化NSE为原料神经元特异性烯醇化酶测定，以山东福隆生物技术有限公司开发的神经元特异性烯醇化酶测定试剂盒为测量平台，用本施行例配制的稳定剂将NSE配制成60ng/mL的碱液，将配好的NSE碱液分成3组，第1组放4℃保存、第2组放温度(25℃)保存、第3组放37℃恒温箱中保存。同时订购商品化的神经元特异性烯醇化酶检查试剂盒，取其中制备成冻干粉的NSE神经元特异性烯醇化酶测定，按其说明书操作加入双蒸水溶化同样配制成60ng/mL的氨水，作为对比组，与实验组一起分别放于4℃、室温(25℃)和37℃保存，保存一定时间后，于全手动物理发光仪上测量其物理发光值的变化，从而估算出其活性变化比率，检查结果如图1至3所示：由图1可知，用施行例1所得的NSE稳定剂稀释NSE在4℃下保存365天后，NSE的活性维持在94%左右，而商品化对照组活性几乎全部失去。

由图2可知，用施行例1所得的NSE稳定剂稀释NSE在温度（25℃）下保存15天后，NSE的活性维持在94%左右，而商品化对照组活性只有15%。由图3可知，用施行例1所得的NSE稳定剂稀释NSE在温度37℃下保存7天后，NSE的活性维持在92%左右，而商品化对照组活性只有2%。通过上述实验对比可知，本发明所涉及的神经元特异性烯醇化酶稳定剂，能大大提升神经元特异性烯醇化酶的保存稳定性，延长试剂盒的货架寿命；简化神经元特异性烯醇化酶检查试剂盒的生产工艺及大夫检查操作过程；提升了神经元特异性烯醇化酶配制、运输和贮存过程中抗质变的能力；增加了由冻干工艺导致的批间差，是一种高效的神经元特异性烯醇化酶稳定性。除上述施行例外，本发明还包括有其他施行方法，凡采用等同变换或则等效替换方法产生的技术方案，均应落入本发明权力要求的保护范围之内。当前第1页1 2 3