高效液相法检查有关物质时容易被误认为是杂质的峰

高效气相色谱法检测有关物质时容易被误觉得是杂质的峰。方式结合日常检测工作和相关文献，对易被误觉得是杂质峰的进行了研究小结。结果易被误觉得是杂质峰的峰包括丙酮峰、有机络合物峰、无机盐类峰和辅料峰,并对这种峰的产生缘由进行简略剖析。剖析工作者在抗生素的有关物质高效气相色谱法的方式开发和检测，规避检测过程中出现的杂质峰给予注重，以免出现错判。

按照药械注册的国际技术要求中杂质的含意，杂质分为有机杂质、无机杂质和残留二氯甲烷。有关物质是杂质的一种，主要是指有机杂质，它或许是原料药合成过程中带入的原料药前体、中间体、试剂、分解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也或许是剂型过程或是在储藏、运输、使用过程中形成的降解物。

有关物质的检测方式太多，主要有薄层色谱法、高效气相色谱法（HPLC法）、气相色谱法和紫外分光色度法等。其中，HPLC法因为分离疗效好、专属性强、灵敏度高，在有关物质检测中最为常用。在选用HPLC法对抗生素进行有关物质剖析时，通常要求视察最大杂质峰面积或各杂质峰面积的和，将其与对照碱液的山峰面积（主成份自身对照品法）或总峰面积（面积归一化法）比较，规定应不少于某一特定的数值。但在实际检测过程中，排除配样引入或则是木柱没冲干净很多诱因外，色谱图上依然会出现保留时间较弱的峰，易被误觉得是杂质峰，因而导致结果的错判。

笔者结合日常检测工作和相关文献苯磺酸氨氯地平滴丸怎么吃，选定了几个具备代表性的品种，将这种易被误觉得是杂质峰的峰归纳为丙酮峰、有机络合物峰、无机盐类峰和辅料峰，并对这种峰的产生缘由进行剖析，以期对抗生素的有关物质HPLC方式的研究和常规检测提供参考。

丙酮峰

在HPLC法中，因为溶化对照品或供试品的丙酮和流动相在某一波速的吸光值不一样，所以形成了吸光值的变化，表现为出现丙酮峰。丙酮峰或许是正常形状的峰，也或许是倒峰，也有或许是一组奇形怪状的峰。降低该类丙酮峰最有效的办法是使用流动相作为丙酮溶化样品，那样既可以防止样品溶剂和流动相之间任何硬度或粘性的不匹配，也可以提高样品剖析时基线的甩尾。

据悉，值得留意的是，在进行有关物质剖析时，要等基线平缓后，再进空白丙酮。通常进样2次，估算供试品碱液的杂质峰时，丙酮峰位置的峰是不参与估算的。

有机络合物峰

《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版（二部）选用HPLC法对苯磺酸氨氯地平的有关物质进行控制。以乙腈-丁醇-0.7%乙酸碱液（取乙酸7.0mL，煮沸至1000mL，用乙酸调节pH值至3.0±0.1）（35:15:50）为流动相，色谱柱为十八甲基硅氧烷键合软胶柱，检查波速为237nm。

标准规定：氨氯地平杂质I峰的峰面积除以2与其他各杂质峰面积的和应不得小于对照碱液山峰面积的1.5倍（1.5%）。实际测试时，氨氯地平的出峰时间为17.5min，并且在二氯甲烷峰出峰的位置有响应较高的峰（保留时间3.0min），色谱图见图1。若将该峰判断为杂质峰，则会出现有关物质超标的状况。将苯磺酸配制成一定含量进样后最终确定该峰为烷烃酸的峰。

还有研究选用气相色谱-四级杆飞行时间质谱联用对苯磺酸的出峰给予确证。苯磺酸为一元有机酸，其pKa为0.7，在一般的流动相pH范围内，苯磺酸氨氯地平主要电离为氨氯地文成离子（被质子化）和苯磺酸阴离子（-），所以，苯磺酸氨氯地平会出现两个峰，一个是苯磺酸（保留时间较短），一个是氨氯地平。

在色谱系统开发过程中，通常会调节流动相pH，与目标缩聚物pKa相差2个单位以上，使抗生素全部电离或结合，那样能够精确定量。对于带有机酸根的缩聚物的固相测试，例如马来酸吡啶那敏、富马酸喹硫平、苯磺酸氨氯地平，在选择的流动相pH条件下，若目标缩聚物以离子型存在，则马来酸、苯磺酸和富马酸等有机酸也会以盐的方式存在，这种有机酸因富含共轭结构均有紫外吸收，因而在气相条件下也会出现一个色谱峰。为此，做这种物质的有关物质和浓度测量时就应留意，不应将有机酸的峰误觉得是杂质峰，或则是将有机酸的峰误觉得是目标缩聚物的峰，导致结果的错判。

无机盐类峰

《中国药械标准》采用HPLC法测试硝酸左氧氟沙星硫酸钠肌注液的有关物质。以氯化铜D-苯丙谷氨酸氨水（取D-苯丙谷氨酸1.32g与硝酸铜1g，煮沸1000mL溶化后，用氢氧化钠试液调节pH值至3.5）-丁二烯（82:18）为流动相，测试波速为293nm。标准规定，供试品碱液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得小于对照碱液山峰面积。实际剖析时，在3.3min出现一个巨大的峰，色谱图见图2。经过剖析苯磺酸氨氯地平滴丸怎么吃，觉得与硫酸稀释后进样的峰位相似，所以在估算有关物质时不应将该峰误觉得是杂质峰。

笔者在参与针对新版药典用的氢溴酸右美沙芬物理对照品的标焦化作中，参照《中国药典》中氢溴酸右美沙芬软膏浓度测量的方式，对氢溴酸右美沙芬进行有关物质检测，流动相为乙酸－乙酸盐缓冲液（取乙酸和乙酸各5mL，煮沸至1000mL）（28:72），测试波速220nm，实际测试时发觉在2.5min出了一个巨大的色谱峰。为了验证该峰，用苯酚稀释后直接进样剖析，结果在同样位置出峰。见图3。因而，在结果判断时，应留意不要误将该峰归列入杂质峰。

类似于富含有机酸的抗生素，富含无机酸的抗生素在一般的流动相pH条件下也均会发生电离，以盐方式存在的缩聚物踏入气相系统后会以游离碱的方式存在，硫酸和氢溴酸是弱酸，也在流动相里电离产生氯离子和溴离子。肖欣等在对不同水底氯离子浓度的比对剖析中，用1cm的石英比色皿，取一定含量的乙酸钠标准碱液作为待测液，辅以紫外-可见分光色度计，扫描范围280~350nm，确定了氯离子在波速为308.7nm左右处有最大吸收。吕伟等研究也验证了溴离子在200~220nm波速范围内有较强的紫外吸收。剖析成因，或许是氯离子和溴离子有8电子的稳定结构而造成紫外吸收，详细成因也有待逐步剖析。

辅料峰

药用辅料是指在药械剂型中经过合理的安全评价的不包括有效成份或前体的组分。诸如，在配制肌注剂时，可以按照抗生素的性质加入适合的辅料，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增丙酮、组丙酮、抑菌剂和抗氧剂等，肌注剂中所用到的辅料应在标签及说明书中说明。对于在HPLC法中会出峰的辅料，在对抗生素进行有关物质检验时，应交纳辅料峰的影响。

《中国药典》收载了青霉素原料及青霉素肌注液，标准规定青霉素原料及其肌注液中单个杂质的峰面积应不得小于对照碱液山峰面积的0.25倍（0.25%），各杂质峰面积的和应不得小于对照碱液的山峰面积（1.0%）。研究发觉，辅以《中国药典》的方式检测青霉素肌注液的有关物质时，对于加有硫酸钠的青霉素肌注液而言，乙酸钠会在青霉素的杂质峰处同样出现吸收峰。

文献报导，氯离子在200~220nm范围内有较弱的紫外吸收，但是氯离子在磺酸型阳离子交换柱上存在离子厌恶，故乙酸钠在色谱柱上基本不保留，对有关物质检测干扰巨大，故在有关物质检验时应排除乙酸钠峰的影响，或则建议企业在青霉素肌注液的处方中标明乙酸钠的量或不加硫酸钠以促使测试。

同时，在对乙酸丙二醇片有关物质研究中，构建了液质联用法确证了色谱图中保留时间2.8min前的色谱峰为聚维酮K29/32的辅料峰，解决了乙酸丙二醇片品质标准中有关物质辅料峰的判断和交纳问题。在交纳辅料峰后，3批乙酸丙二醇片样品的有关物质结果均符合规定，为《中国药典》中硫酸丙二醇片品质标准修订提供了参考。

据悉，《中国药典》收载的阿奇霉素分散片的有关物质检测明晰规定了估算时给予交纳相对保留时间0.12之前的色谱峰为辅料峰，必要时应取辅料进行对照。研究阐明，罗地塞米松分散片中的辅料香兰素钠的保留时间受仪器、色谱柱、流动般配比影响不大，在一定的流速范围内只按照保留时间才能挺好地对其进行定性，在做有关物质检测时可以直接将其交纳。

国家药典执委会药典业化函8号文对杂质峰的问题作了如下规定：“杂质峰不包括丙酮峰和确认的辅料峰，药械说明书应列举剂型中所用辅料名称”。根据理解，已被确认的辅料峰在有关物质判断时不被觉得是杂质峰，可以将其交纳。但将其交纳前应当对其进行研究，以确认其确实为某些辅料峰，而非辅料中的杂质峰，如未能确认是什么辅料则难以交纳。

笔者建议，在剂型的有关物质方式开发中，也可以避免辅料存在的吸收波速，同时选定主成份和各杂质的特性波速，使辅料无吸收或有较短线收，以清除或增加辅料峰的干扰；或则修改提取丙酮，运用药用辅料和主药的溶化性差别，在充分了解辅料和主药理化性质的状况下更换提取丙酮，将辅料峰降至最低干扰，从而可以忽视不计。

结语

抗生素中有关物质的研究是抗生素研制和品质控制的一个重要方面，贯串于药械研究、生产和存储的整个过程。这就要求剖析工作者对检测过程中出现的杂质峰给予注重，以免出现错误的结果。只有这么，能够真正使HPLC法测量有关物质的检测数据精确、可靠。