硝化细菌的作用 基于基因组解析的定量宏转录组学（-）方法

研究摘要

药物抗性的日渐降低和广泛传播给全球应对真菌感染产生了巨大的挑战。废水厂中蕴涵和排放的药物抗性基因已被公觉得新型的污染物。虽然这么硝化细菌的作用，对于抗性基因的寄主身分、活性和功能习性的知识空白限制了对于废水处理厂中的药物抗性基因组的鉴别和风险评估。本文借助基于基因组解析的定量宏转录组学(-)方式，定性和定量的剖析了在12个废水处理厂中不同抗性基因真菌寄主的抗药性、病原性、活性和其功能。作者发觉在恢复的248个基因组中，有约45%的基因组抒发了多种类型药物的抗性基因。其中变型菌门真菌同时携带球菌肽和甲基香豆素类药物抗性基因的现象尤为明显。群落中潜在病原菌和土著反硝化菌均为活跃的抗性基因寄主。文章结果显示，在废水处理厂微生物群落中存活了包括潜在病原菌在内的大量抗药群落，且其中大部分群落成员（66.9%）的抗性基因持续抒发。该推论为未来废水排放的安全风险评估起到指导作用。

材料与技巧

1.基于基因组的微生物组数据集剖析

本文剖析的47个微生物群落采样于12家德国的废水处理厂的初沉池，反硝化池，硝化池和二沉池出水（采样时间为2016年3月-4月）。关于具体的样品采集详情、高通量测序、污水厂运行参数可参考本文通信作者的另外一篇文章：Ju,F.;Beck,K.;Yin,X.;,A.;,C.S.;,H.P.;,D.R.;Zhang,T.;,H.plantareby,,andinthe.ISMEJ.2019,13,346-360。

2.基于基因组解析的宏基因组数据剖析

总体数据处理参考(v1.2.2)流程，总体而言，47个样品的序列被单独的组装和分箱。高质量的基因组（完整度-5*污染度≥50）通过dRep(v1.4.3)消除重复的基因组，总共得到248个奇特的高质量的组装基因组（MAGs）。所有MAGs序列都上传至中国国家基因库（/，获取号：）。

3.抗性基因的注释和联通性预测

组装基因组的抗性基因通过(v2)注释（“--align--genes--prob80--iden50）。结果得出在162个MAGs中共得到496个明晰类型的抗性基因，在117个MAGs中找到了多抗性类型（）的抗性基因。按照注释结果，将248个MAGs分为多重抗性基因组（multi-），单抗性基因组（）和无抗性基因组（non-）。

考虑到可联通基因器件（比如：引物）在抗性基因传播的过程中的重要作用，文章用(v1.1)预测了在宏基因组数据中的引物序列。同时通过对照pfam数据库，注释了数据集中的可联通遗传器件。通过抗性基因在基因组中的位置（在引物上或临近可联通遗传器件），预测抗性基因的联通性。

4.病原菌的鉴别

首先通过微生物物种分类鉴别结果与公共卫生领域所公认的病原菌属种（140属和538种）进行对比，得到可能的病原菌。并将可能的病原菌与病毒力因子数据库（VFDB，2020年6月27日更新）进行比对，以确定其身分。

5.硝化/反硝化功能基因注释

借助将MAGs中预测的基因与氮循环基因数据库进行比对，结果在88个MAGs中得到283个硝化/反硝化基因。

6.基于基因组解析的定量宏转录组剖析

基因组层面的定量剖析：将每位样品的DNA和RNA序列联配至对应的重叠群（）和基因预测集（gene）并估算覆盖度（）。基因组的平均相对产率和活跃度通过RPKM(readsperper)表征。

基因绝对定量剖析：为消弱相对定量剖析的局限性，本文通过估算AEV（）对抗性基因抒发进行了绝对定量剖析。AEV以/g-VSS为单位，其具体估算公式为：

其中RIS为样品中加入的内标的条数，为样品的可挥发漂浮有机物质量，Ngene为数据中得到的特定基因条代数，Lgene是特定基因的宽度，NRISreads是内标基因的条代数，LRIS是内标基因的厚度。更多关于定量宏基因组学与定量宏转录组学方式介绍请参考引文【45】：Huang,X.Y.;Zhang,L.;Yuan,L.;Ju,F*.andof.（微生物组的定量宏基因组学和定量宏转录组学技巧）Bio-1012021,。

本文还定义相对基因抒发RER（ratio）：

其中（）为GTDB-tk定义的120个真菌的单拷贝标记基因AEV的中位数。文章定义RER小于1，则觉得该基因较真菌中的看家基因（house-gene）过抒发。

结果与讨论

1.废水厂微生物MAGs的总体概况

本文在47个样品中总共提取了1844个MAGs硝化细菌的作用，经过质检和去重得到了248个奇特的高质量的MAGs进行剖析。恢复的MAGs分布在(88),(68),(39),(22),(11),和(4)等15个门类（图1）。

图112个废水处理厂中获取的284个MAGs的系统发育树

2.抗性基因的寄主身分、表达活性和可联通性

文章在248个MAGs中找到了162个携带抗性基因的寄主（图2）。其中113个MAGs为多药抗性，49个MAGs为单药抗性。在多药抗性基因组中，基因组（media）拥有11个属于9个类型的抗性基因。从物种分类角度，在15个门属中，11个门的真菌拥有抗性基因组。其中门拥有最多的抗性基因组。在该门88个基因组中有84个基因组拥有抗性基因（超过13个抗性基因类别），且绝大多数抗性基因都彰显了转录活性。与相反，门的基因组中只有少量的抗性基因组（10/68），且只有一个基因组有抗性基因转录活性。

在鉴别下来的496个抗性基因中有460起码在一个样品中具有转录活性。所测量到的抗性基因覆盖14个类型。其中球菌肽和甲基香豆素类药物抗性基因最为常见，且主要寄宿于。而β-内丙酯和膦胺霉素的抗药基因最为罕见。最活跃的的抗性基因是磺胺类抗性基因（2.53×/g-VSS），此后则为链霉素抗性基因（1.51×/g-VSS）和氨基酸药物抗性基因(1.46×/g-VSS)。而氟喹诺硫醇抗性基因最不活跃(1.42×/g-VSS)。多药性抗性基因的广泛存在和持续抒发给废水厂的抗性风险评估叩响警钟。

图2获取的MAGs中的抗性基因分布

另外结果在在引物序列中找到了11个抗性基因，其中三个抗性基因被潜在病原菌携带。但因为真菌基因主任存在多个引物，且种间差别不清晰，好多引物都难以进行确切分箱。与此同时，结果还显示有35个抗性基因临近可联通遗传器件，为抗性基因提供潜在联通性。

3.废水处理厂中病原菌的分布及其抗性剖析

依照物种分类信息以及毒力因子比对，在群落中找到了20个潜在病原菌基因组，且多数（17）彰显多药抗性。潜在病原菌在（由恢复MAGs所代表的）进水群落中可以占比47.3%的产率和65.5%的活跃度。测量到的病原菌包含了（3），media（9），（4），（3）和（1）。进水中的病原菌在废水处理过程中几乎难以被测量到，但在出水中又重新被测量到。作者推测，这种病原菌可能缘于人类的排尿物的底栖真菌，在废水处理过程中没有完全被混凝清除，残留的病原菌会随废水出水排放至受纳底泥。

4.生物氮循环与多病抗药性的交互关系

在废水处理微生物群落中按是否拥有氮循环功能基因筛选出88个具有氮循环功能潜力的MAGs（图3）。其中参与反硝化过程的真菌多样性（87MAGs，5门）远低于硝化真菌（5MAGs，3门）。在反硝化病菌的群落中，8个MAGs拥有完整的反硝化路径，其余79个MAGs仅拥有部份路径。与不参与氮循环的真菌群落携带抗性基因的百分比（10/86）相比，氮循环真菌携带一个或多个抗性基因的可能性显著更高（硝化菌，3/5和反硝化菌，75/87）。尤其是在硝化和反硝化过程中起到重要作用的基因组中有65.9%的基因组具有多药抗性。文章作者推测在氮循环真菌编码的耐药基因有助于在废水中存在药物选择压力胁迫情况下维持废水处理厂的运行效率。

图3MAGs中获取的氮循环功能基因以及其与抗性基因

5.废水处理过程中抗性基因的活跃寄主

基因组数据剖析结果显示大部份（18/20）的潜在病原菌高度抒发抗性基因，占约38%的抗性基因抒发，其中14个潜在病原菌参与到了反硝化过程。硝化菌总体来说不抒发抗性基因，而反硝化真菌，尤其是土著反硝化真菌中的抗性基因高度抒发。硝化与反硝化真菌在抗性基因抒发上的不同彰显了其在应对环境风险和生存策略的差别性（图4）。潜在病原菌和土著反硝化菌两个类群共占所有恢复MAGs中抗性基因总抒发量约60%，是废水处理厂中抗性基因的重要寄主。

图4废水处理厂中真菌抗性基因的绝对活性和相对活性

在不参与生物氮循环的抗性MAGs中，有35个MAGs在除氮反应器中明显抒发了抗性基因。依据文献对比，这种MAGs可能参与到活性淤泥的混凝和辅助氮循环真菌生长的作用。绝大部份的抗性基因活性可以在废水处理的过程被有效清除。但是，出水中一直存在了121个有抗性基因活性的MAGs。其中有6个多药抗药的MAGs在出水中的抗性基因抒发超过1×1010/g-VSS。

对于抗性基因和氮循环基因的相对活性剖析结果得出，抗性基因在废水处理过程中抒发程度相对低（RER∼0.4），且在整个过程中变化不显著。氮循环功能基因被明显抒发（RER~4.6，反硝化~80.1硝化），彰显了氮循环在废水处理过程中的重要作用。

研究意义和重要性

该研究首次解析了废水处理过程中微生物药物抗性和脱氮功能的交互作用。同时通过基于基因组解析的定量宏转录组剖析，深入剖析了抗性基因和氮循环基因在废水处理过程中抒发程度。研究推论强调，废水处理的微生物群落中的病原菌和土著反硝化菌是抗性基因的主要寄主，且在废水处理过程中并未被完全清除。因而应对已处理的出水慎重处置以免带来安全风险。同时，本研究首次构建了的基于定量性基因组解析区分的绝对定量宏转录组的剖析方式。该方式可以有效地规避了传统方式的局限性，可以确切的剖析基因组和抗性/功能基因在不同样品中的产率、活性和可联通性。该方式对未来工程微生物组研究的数据剖析具有指导意义。

通信作者简介

鞠峰，西湖学院研究员、博士生导师，环境微生物组与生物技术实验室（）负责人，广东省海岸带环境与资源研究重点实验室副组长，中国工程院院刊编委、CellPress旗下The青年编辑、系列、、and刊物编委与审稿编辑，曾兼任美国自然科学与工程理事会（NSERC）国际评审专家，国际微生物生态学会(ISME)、国际水商会(IWA)、中国环境科学学会会员(CSES)。2015年获台湾学院工学博士学位，2015-2018年在英国联邦水科学与技术研究所(EAWAG)从事微生物生态与药物耐方子向博士后研究，2018年至今在西湖学院兼任特聘研究员。鞠峰博士从事环境生物技术与微生物组学研究，曾获中国生态学会“水云天微生物生态青年科技创新奖-特等奖”（2018）、香港科学会“青年科学家奖”（2016）、香港学院“杰出研究型研究生奖”（2015）。目前参编“环境生物技术”主题英语著作章节2篇和“微生物组”主题英文著作章节5篇，在TheISME(4篇)、&(9篇)、Water(4篇)、oftheTotal(4篇)等环境生态学与微生物学领域著名刊物发表学术论文40余篇，微软学术引用3000余次。实验室陌陌公众号：，主页: